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细胞凋亡检测技术与方法,研究表明线粒体酶如何触发细胞死亡

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自噬,自噬,不就是自己吃自己么?

核心提示: 细胞凋亡(Apoptosis),又称细胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death),是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身 细胞凋亡(Apoptosis),又称细胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death),是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束其生命的过程。它是一个主动的,高度有序的,基因控制的,一系列酶参与的过程。细胞凋亡概念提出至今还不到30年的时间,但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色,对个体的正常发育及细胞凋亡紊乱在病理学研究中的重要作用,引起了人们对其机制和组分的广泛而深入地研究,成为目前生命科学界最为热门话题之一,也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域。从近年的SCI排名中我们可以看到,信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组方面的,而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究。随着这方面研究的持续升温,涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测,其中不少已经有商品化的产品出现,大大加速了研究的进程。具体来说,针对凋亡的不同阶段有以下一些方法。

细胞凋亡研究获进展 来自美国纽约西奈山医学院,圣裘德童研究医院等处的研究人员发表了题为Sphingolipid Metabolism Cooperates with BAK and BAX to Promote the Mitochondrial Pathway of Apoptosis的文章,解析了细胞凋亡相关的细胞色素C释放,这将为进一步揭示细胞凋亡的秘密提供了重要信息,这一研究成果公布在Cell杂志上,同期杂志还配发的相关点评文章。文章的通讯作者分别是西奈山医学院Jerry E. Chipuk,以及圣犹大儿童研究医院Douglas R. Green教授,其中Green教授是世界著名的免疫学家,其方向主要是细胞凋亡或主动细胞死亡的相关研究,并探讨这一过程在调控免疫系统中的作用。Green教授发表过多篇重要的论文,曾以113篇论文高达15,000次的引用率位居全球论文被引用次数最多的前五名科学家之列,其中有两篇论文的引用次数位列全球引用次数最多的论文前25位。线粒体在功能上和物理结构上都异型膜存在关联,但是关于这些相互作用如何影响线粒体外膜通透性,以及细胞凋亡的,目前还知之甚少。在这篇文章中,研究人员发现线粒体异型膜分离能抑制依赖于BAK/BAX的细胞色素c的释放细胞色素C是一种细胞色素氧化酶,是电子传递链中唯一的外周蛋白,位于线粒体内侧外膜,研究发现细胞色素C与细胞凋亡有关,从线粒体中泄露出的细胞色素C有诱导细胞凋亡的作用。研究人员通过生化方法纯化与MOMP敏感性有关的中性中性鞘磷脂酶,发现脂质代谢能调控BAK/BAX活性。之后他们又纯化了脂质和酶,证明通过体外重构鞘脂代谢途径能提高MOMP敏感性。而且研究人员还发现脂质代谢抑制剂能阻断重膜准备中的MOMP,但不会影响纯鞘重构化过的线粒体MOMP。鞘脂产物:sphingosine-1-PO4 和hexadecenal还能与BAK和BAX特异性协同作用。这些都说明了细胞对凋亡作出应答需要鞘脂代谢(sphingolipid metabolism)的参与。这项研究也表明BAK/BAX活性和细胞凋亡能调控特殊脂质环境,这一环境是由于异型膜-线粒体相互作用维持的。更多阅读《细胞》发表论文摘要特别声明:本文转载仅仅是出于传播信息的需要,并不意味着代表本网站观点或证实其内容的真实性;如其他媒体、网站或个人从本网站转载使用,须保留本网站注明的来源,并自负版权等法律责任;作者如果不希望被转载或者联系转载稿费等事宜,请与我们接洽。

细胞色素c是一种小酶,在线粒体产生能量中起重要作用。它还涉及发出危险问题的信号,这些问题需要细胞凋亡或程序性细胞死亡。使用固态核磁共振,格罗宁根大学固态核磁共振波谱学副教授Patrick van der Wel及匹兹堡大学的同事们发现,细胞色素c诱导的信号比预期更有控制。结果于3月14日发表在 结构 杂志上。

去年的诺贝尔生理学或医学奖又发给了一个日本人,大隅良典。这是谁啊。这可是一个在行业里鼎鼎大名的人哟。颁奖给他的理由就是他发现了细胞自噬的机制。细胞大家都知道,那自噬又是什么鬼?让我们一一道来。

1. 早期检测:

如果细胞发生故障,身体想要在它们造成更多伤害之前摆脱它们。不同的信号可以驱使细胞通过细胞凋亡自我毁灭。广泛的程序性细胞死亡有助于神经退行性疾病如亨廷顿舞蹈病的发展。诱导细胞凋亡的强烈信号是心磷脂的氧化,心磷脂是一种磷脂,仅存在于细胞的发电站线粒体膜中。线粒体有两个膜,这种心磷脂主要存在于内膜中,Van der Wel解释道。当它被氧化并移动到外膜时,就会引发细胞凋亡。

大隅良典研究的是酿酒酵母的自噬机制。酿酒酵母是一种模式生物,非常经典。经过20多年的研究,酵母里已经发现了34种与自噬有关的基因。那自噬到底是什么?

1) PS在细胞外膜上的检测:

原子

其实自噬就是自己吃自己。只不过不是用嘴吃,毕竟细胞没有嘴嘛。自噬就是细胞自己降解自己的结构,把一些暂时用不上的零件,拆解变成最小的模块,然后重新组装成自己需要的东西。这就是自噬了。

PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生, 可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV,一个钙依赖性的磷脂结合蛋白,能专一性的结合暴露在膜外侧的PS,再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测(悬浮细胞和贴壁细胞都适用),可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。

阻止心磷脂氧化的药物也可以减少细胞死亡,并可以减缓动物模型中亨廷顿舞蹈病的进展。然而,细胞通过细胞色素c的催化活性加速氧化过程,细胞色素c是一种含有反应性血红素基团的酶。这表明氧化事件不是偶然的,但也可能是细胞有用和理想的信号,Van der Wel解释说。

在植物细胞和酵母细胞里,自噬在液泡里发生。在动物细胞里,自噬在溶酶体里发生。从一个蛋白质到整个细胞器,都是可以降解的。当然,这些东西都是氨基酸组成的。

美国著名生物试剂公司CLONTECH和INTERGEN公司分别开发了多种标记的Annexin V产品,简便快速,10分钟就可完成检测。其中带荧光标记的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC,灵敏度高,可作为FACS方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白Annexin V-EGFP,EGFP与PS 的结合比例为1:1,还可进行定量检测。除此之外,还提供生物素偶联的Annexin V,可通过常用的酶联显色反应来检测。另外,MACS公司将磁珠包被Annexin V,可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。

Van der Wel想要了解细胞色素c对心磷脂的氧化是如何通过研究酶与线粒体膜相互作用时的行为而发生的。为此,他使用了固态核磁共振,这种技术可以让科学家研究分子中的原子,如蛋白质或脂质。通过核磁共振测量的原子信号受到原子周围环境的影响。因此,蛋白质形状的改变会改变信号。Van der Wel将溶液中的细胞色素c与膜结合细胞色素c进行比较,以了解与膜的相互作用如何改变其结构。

自噬是细胞内分解代谢的一种途径。除此之外还有一种途径,称之为泛素蛋白酶体途径。简单说就是把蛋白质上加个泛素,做个标记,然后送进蛋白酶体去消化。

2)细胞内氧化还原状态改变的检测:

蛋白质循环

自噬发现的历史是这样的。

这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势,研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通过荧光染料monochlorobimane体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化。正常状态下,谷光苷肽(glutathione:GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要,许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。在Jurcat和一些其它类型的细胞中,细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时,细胞液就由还原环境转为氧化环境,这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低,从而使细胞色素C(三羧酸循环中的重要组分)从线粒体内转移到细胞液中,启动凋亡效应器caspase的级联反应。

我们预计蛋白质会在膜内,处于展开状态,暴露出反应性血红素组。 然后血红素会轻易氧化心磷脂。但是,结果显示出不同的结果。酶不进入膜但与含有心磷脂的膜结构域结合,并保持折叠状态。然而,覆盖血红素组的蛋白质环有时会移开,将磷脂暴露于血红素组。

首先,1956年的时候Clark用电镜在小鼠的肾细胞里发现一些膜结构的东西,还挺充实,里面含有很多细胞质里的东西,甚至有线粒体。

由于 GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关,此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外,还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究。但有些细胞如:HeLa 和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH水平的变化,不能用此法检测。

该观察结果表明,心磷脂在细胞凋亡中的作用在一定程度上受到调节,而不仅仅是对氧化条件的被动反应。这可能对细胞死亡起重要作用的疾病有影响。如果细胞色素c的活性形式仍然被折叠,那么就有可能开发出阻止其氧化心磷脂的药物。 另一个可能的干预点是酶与特定膜结构域的结合。最后,线粒体的问题可以诱导细胞凋亡或仅受影响的线粒体的侵入性较小。如果我们能够理解这种选择是如何做出的,那么我们也许能够影响这一过程。

然后在1963年开了一个溶酶体会议,, Christian de Duve第一次把这种东西称为自噬。

3)细胞色素C的定位检测

物料

到了上世纪90年代,Daniel J.Klionsky和Yoshinori Ohsumi(就是大隅良典)开始用酵母研究自噬了。

细胞色素C作为一种信号物质,在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下,它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中,凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液,结合Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)后启动caspase级联反应:细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9,后者再激活caspase-3和其它下游caspase。细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit Ⅳ:COX4)是定位在线粒体内膜上的膜蛋白,凋亡发生时,它保留在线粒体内,因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。

结构论文中描述的实验是在匹兹堡大学进行的,Van der Wel去年在转学到格罗宁根大学之前就在那里工作。他现在正在Zernike先进材料研究所建立一个固态核磁共振组,该研究所是科学与工程学院的一部分。这项技术也将用于研究蛋白质折叠的替代方法,例如,淀粉样蛋白的形成。这些蛋白质聚集体在神经退行性疾病中发挥作用,但它们也可用于设计新的功能材料。

再后来就是越来越多科学家加入了研究自噬的队伍。

ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超离心,可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分,再进一步通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置,从而判断凋亡的发生。

细胞自噬分为三种方式。这是根据如何打包物质和如何运送物质来划分的。

4) 线粒体膜电位变化的检测:

第一种叫宏自噬,也叫巨自噬,顾名思义就是比较大,细胞膜或者其他的双层膜去把那些不想要的东西包裹起来,然后和溶酶体融合。这一般是比较大的细胞器之类。

在凋亡研究的早期,从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的深入,发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分,发生很多生理生化变化。例如,在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化,导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM,一个阳离子性的染色剂,对此改变非常敏感,呈现出不同的荧光染色。正常细胞中,它在线粒体中形成聚集体,发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中,因线粒体穿膜电位的改变,它以单体形式存在于细胞液中,发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变化。但是,这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。

第二种叫微自噬。顾名思义就是比较小,就是溶酶体或者液泡直接用自身去吞噬那些需要降解的东西。也许是细胞器,也许是蛋白质。

2. 晚期检测:

第三种叫分子伴侣介导的自噬。这个是指分子伴侣将细胞内的蛋白质先从折叠状态恢复为未折叠的状态,再放到溶酶体里。

细胞凋亡晚期中,核酸内切酶(某些Caspase的底物)在核小体之间剪切核DNA,产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。对于这一现象的检测通常有以下两种方法:

这三种自噬就是自噬全部的方式了。第一种是最主要,也是研究最透彻的。所以狭义上巨自噬就是自噬了。

1) TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling)

另外,自噬分为两种,非选择性自噬和选择性自噬。在酵母中,选择性自噬还分为cvt途径,线粒体自噬和过氧化物酶体自噬。第一个的意思是把细胞中的氨基肤酶、甘

通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP 间接或直接接到DNA片段的3’-OH端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。美国Intergen公司提供多种标记方法,直接荧光标记,地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色,可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。其中,直接标记步骤少,操作简便。而间接标记有信号放大的作用,检测灵敏度高。

露糖酶等酶的前体送到液泡里,把这些酶激活,再送回细胞质,从而发挥其水解酶的作用。

2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)

酵母细胞里只有第一种,巨自噬。

当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少时,直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通过LM-PCR(ligation-mediated PCR),连上特异性接头,专一性地扩增核小体的梯度片段,从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。此外,LM-PCR 检测是半定量的,因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。

自噬是这样发生的。

上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征,但细胞受到其它损伤(如机械损伤,紫外线等)也会产生这一现象,因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。

第一步是细胞核发出一种信号,指示细胞里某个部分需要降解了,或者是那些垃圾诱导细胞产生了某种反应,于是自噬发生了。这些信号被细胞接受以后,酵母细胞里是在一个称为Atg8的蛋白质附近,也称为PAS附近,形成自噬体。而哺乳动物细胞是在内质网和线粒体接触的某个地方,开始逐渐形成一种扁平的,类似碗的形状的一种双层膜结构。这种结构不断延伸,扩张,最后变成了自噬体。这个膜可能是是某些细胞器膜分出一部分去包裹那些将要被降解的东西,比如如内质网、高尔基体、内吞体、质膜和线粒体都有可能。当然也有可能是在原地立马组装出一张膜来。包裹起那些不要的东西。这一步就是形成了自噬体。这是暂时的。

3) Telemerase Detection

第二步就是自噬体逐渐扩张,收口,包裹那些垃圾了。自噬体是球型的。

这是相对来说推出较早,用得较多的一种方法。端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白,它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列,使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的,每分裂一次,染色体的端粒会缩短,这可能作为有丝分裂的一种时钟,表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现,90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物,分别与底物及端粒重复序列配对的引物。如果待测样本中含有端粒酶活性,就能在底物上接上不同个数的6碱基端粒重复序列,通过PCR反应,产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的DNA Ladder现象。此外,Intergen公司还提供用酶联免疫法检测的试剂盒.

第三步就是自噬体和液泡或者溶酶体融合了。反正都是膜,融合起来毫无压力。

同样,这种检测方法也不专对细胞凋亡,检测结果也不纯反应细胞凋亡的发生。

第四步也是最后一步,就是自噬体和液泡或者溶酶体融合以后,那些不要的东西在某些酶的作用下分解了。分解成氨基酸脂肪酸之类,剩下的残渣就排出细胞了。当然也可能暂时留着。说不定能废物利用呢。

3.mRNA水平的检测

提到自噬,你一定还能想到一个词。凋亡。那这俩是不是一回事呢?

研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因,检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道,Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells)等靶细胞。Bcl-2 和bcl-X 作为抗凋亡(bcl-2 和bcl-X)的调节物,它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。一般多采用Northern杂交和RT-PCR走胶对它们进行检测。随着近年来荧光定量PCR技术的发展,用定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。Intergen公司的Amplifluor? Apoptosis Gene Systems就根据这一新技术原理,通过检测fas, bax-alpha 和 bcl-X 基因的 mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

答案是否定的。自噬和凋亡不是一回事。那他们有没有关系?这个必须有了。

以上介绍了针对凋亡不同阶段特征的检测方法,随着凋亡机制研究的深入,近年来还发展了许多针对特定的凋亡途径的检测,如抗体法,酶活性测定等等,Cell Signeling technology公司,DAKO公司,Santa-Cruz公司,Calbiochem & Oncogene公司都紧跟科研潮流,开发了大量的抗体及活性测定产品。我们将陆续报道这方面的技术方法与产品。

细胞死亡分为三种,坏死,凋亡,自噬性细胞死亡。自噬和凋亡是并列的。

坏死就是机体受到损伤,细胞代谢停止,功能丧失。溶酶体里的水解酶释放分解了整个细胞,或者是白细胞大老远的跑来释放了水解酶。

凋亡也称为1型程序性细胞死亡。依靠的是胱冬肽酶等一大堆水解酶。细胞凋亡有以下特点:染色体浓聚、细胞皱缩、DNA降解和凋亡小体形成。这个是高中生物书上就有的啦。最后残余部分被巨噬细胞吃掉。

而自噬也叫2型程序性细胞死亡。这个纯粹是依靠溶酶体的。不依赖某些酶。

那凋亡和自噬有什么关系?凋亡和自噬是一种动态平衡。自噬可能比凋亡早发生,从而启动凋亡。自噬也可能抑制凋亡,从而保护细胞。自噬还可能向凋亡转化。

就这三步,自噬就完成了。但是这里面有一个问题。最初包裹那些垃圾的膜是从哪来的呢?

在酵母里,这个过程是这样发生的。膜会在自噬体组装位点(PAS,这个位置是靠近液泡的),在Atg8还有其他蛋白质的作用下开始扩展生长。然后就这么长成了自噬体。

而在哺乳动物细胞里,过程就不一样了。形成自噬体的区域是分散在整个细胞里的。于是我们现在有非常多的假说。

第一种假说认为,自噬体膜是来自内质网的。而自噬体就形成在内质网和线粒体接触的地方。所以还要一直说法认为自噬体膜来自线粒体外膜。

还有三种假说分别认为自噬体膜来自高尔基体,内吞体(就是从细胞膜上的胞饮)还要细胞膜。这些假说各有证据,目前还很难说哪一个是对的。也许都是对的。谁知道呢。

自噬就是这么个玩意。你大概懂了不?自噬在细胞里是一个非常保守的过程,很少进化。自噬的出现是为了适应环境,尤其是碰上不好的年景,比如缺乏营养啦,饿着啦,压力特别大啦,或者氧气水分特别少什么的,就需要自噬了。

自噬现在对于临床研究非常重要。比如,肿瘤经常在环境非常差的时候还能生长,就是因为肿瘤细胞的自噬非常剧烈。所以理论上如果阻断了肿瘤细胞的自噬,它们不就不会生长了吗?

再比如一些神经退行性疾病,如帕金森,就是大脑里出现了一些错误折叠的蛋白质。而且还清除不掉。本质上也是自噬出了问题。

自噬还和免疫有关。总之,自噬目前的研究还不够深入,尤其是关于自噬的基因和自噬的机制。所以,我们就等待科学家们再努力一下吧~